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制药工艺学

我不是学这个的，我在了解一些关于医药中间体的时候，发现了这个资料，据推荐的人说这个资料是比较好的，所以，顺便整理了一下，帖在这里，希望对需要的人有些用处。

第一章　绪论

1.1 制药工艺学
1.1.1 制药工艺学的研究对象
      制药工艺学是研究药物的工业生产过程共性规律及其应用，包括制备原理、工艺路线、质量控制。 现代制药的特点是技术含量高、智力密集，发展方向是全封闭自动化、全程质量控制，大规模反应器生产和新型分离技术综合利用。
       制药工艺学的工程性和实用性较强，加之药品种类繁多，生产工艺流程多样，过程复杂。即使进行仿制药物的生产，也必须要有自主知识产权的工艺。制药工艺作为把药物产品化的一种技术过程，贯穿于药物研发的整个过程，是现代医药行业的关键技术领域。制药工艺是药物产业化的桥梁与瓶颈，对工艺的研究是加速产业化的一个重要方面。因此，学习掌握制药工艺学具有重要意义。

1.1.2 制药工艺学的内容
        制药工艺学是综合应用化学系列、生物系列、机械设备与工程单元c作等课程的专门知识，深化理解并掌握工艺原理，充分考虑药品的特殊性，针对生产条件、所需环境等的具体要求，研究药物制造原理、工艺路线与过程优化、中试放大、生产技术与质量控制，从而分析和解决生产过程的实际问题。从工业生产角度，改造、设计和开发药物的生产工艺，制定相应的c作规程。
       制药工艺学与其他基础课、专业课联系密切，而且与生产实践紧密相关。通过设计、研究药物大规模生产的工艺条件与设备选型，从中选出最安全、最经济、最可行的工艺路线。

1.1.3 制药工艺的类别
       可根据典型的药物生产过程，把制药工艺过程分为4类，生物技术制药工艺学、化学制药工艺学、中药制药工艺学和制剂工艺学。

1.1.3.1 生物技术制药工艺
        以生物体和生物反应过程为基础，依赖于生物机体或细胞的生长繁殖及其代谢过程，利用工程学原理和方法对实验室所取得的药物研究成果进行开发放大，在反应器内进行生物反应合成，进而生产制造出商品化药物。细胞生长和药物生产与培养条件之间的相互关系是过程优化的理论基础。
        可把生物技术制药工艺分为上下游过程。上游过程是以生物材料为核心，目的在于获得药物，包括药物研发、细胞培养工艺、放大及大规模细胞培养研究等。属于生物加工过程，如酶工程、基因工程技术、细胞培养工程、发酵工程等。下游过程是以目标药物后处理为核心，属于生物分离过程，包括药物的提取、分离、精制工艺，药物产品的检测及质量保证等。
        生物技术制药工艺过程包括菌种或细胞的选育，培养基的特性与制备，无菌化c作，培养工艺的控制等。生物制药技术的学科基础包括生物化学、分子生物学、免疫学、酶学、细胞生物学、微生物学等多门学科，为药物表达和分离纯化提供方法和原理。合理设计生产工艺路线需要考虑，高效表达的载体及宿主系统，洁净室、水系统、空气等公用设施，在线实时检测的设备与生物反应器，才能有效地实现过程的控制与优化。

1.1.3.2 化学制药工艺
       化学合成药物的生产工艺原理、工艺路线的设计、选择和改造。因为有易燃易爆、有毒的原料与中间体，要求最安全。成本最低，要求最经济。工艺路线最短，最简，易于组织生产，要求最便捷。三废，废水、气、渣必须处理并减少到最低，需要无污染、绿色环保工艺。化学制药涉及课程有有机化学、分析化学、物理化学、药物化学、药物合成反应，有机合成，制药设备与设计等。
       化学药物合成可以分为全合成和半合成两种。全合成药物由简单的化工原料经过一系列的化学合成和物理处理过程制得；半合成药物是由已知的具有一定基本结构的天然产物经过化学结构改造和物理处理过程制得。

1.2 天然提取制药技术发展

天然提取制药是指直接从天然材料中使用分离纯化等技术制备药物。现代药物最初来源于植物、动物和微生物，而且以提取分离为先导。
       15～17世纪，欧洲有了金鸡纳、愈创木、药喇叭根、古柯果和可可等。

      19世纪，掀起了天然提取分离药物的热潮，从植物中分离出纯的有效化学物质。从鸦片中提取出吗啡结晶；从吐根中分离得活性成份吐根碱。从金鸡纳树皮分离得到了奎宁，成为最早用于治疗疟疾的药物。从莨菪中提取了阿托品，从古柯叶取得了可卡因；从洋地黄叶子获得洋地黄甙晶体。
       在20世纪50年代后，随着对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解，生产工艺技术提高，改变了原来的混合制剂，生产制备高纯度单一特异性组分的生化药物制剂，如猪牛胰岛素、前列腺酶及辅酶、激素、脂类、蛋白质和核酸及其降解产物等。生化药物品种迅速增加，已成为一类重要的药物。
        由于合成工艺、技术等因素的限制，仍然有些氨基酸、维生素、核苷酸、酶、多糖、脂类等仍然不能合成生产，必须直接从天然材料中提取。还有一些手性药物和半合成药物的中间原料也必须从天然材料中直接提取。

1.3 生物技术制药发展

1.3.1 生物技术药物
        生物技术是整合自然科学和工程科学，生产细胞产品和分子产品，生物技术制药就是采用生物技术生产制造药物。生物技术药物（biotechnology medicine）是利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、治疗和诊断功能的药品，包括多肽、蛋白质、酶和核酸以及具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。
        20世纪80年代，生物药物（biopharmaceutical）是指用现代生物技术生产的治疗性药物，它基于重组DNA技术和杂交瘤技术生产的药物，不包括直接从天然组织、器官、血液等中提取的生化药物。随着生物技术的发展，以核酸为基础的治疗性药物也属于生物药物。
        在制药领域，生物技术药物（biotechnology medicine）、生物技术产品（biotechnology product）、生物技术制品（product of pharmaceutical biotechnology）有时候也互换使用。在相关法规中，经常出现的术语是生物制品 (biologics，biologic product, 中国、美国使用)、生物医药产品（biological medicinal product，欧盟使用）。

       中国生物制品规程对生物制品的定义：以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗体、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品和体外免疫诊断制品等。在此基础上，分为预防用生物制品、治疗用生物制品和诊断用品三类。预防用生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素；治疗用生物制品包括抗血清与抗毒素、血液制品、细胞因子与抗体；诊断用品包括细菌学试剂、免疫试剂、临床化学试剂。

1.3.2 微生物发酵制药
        对微生物进行培养，生产有用化学物质的过程就是发酵过程。采用微生物发酵生产药物就是微生物发酵制药。
        发酵技术大规模应用于制药是第二次世界大战期间，诞生了以抗生素为代表的次级代谢产物的工业发酵。搅拌发酵沉没法生产成功，提高了供氧和通气量，同时在菌株选育、培养和深层发酵、提取技术和设备的研究取得了突破性进展，给抗生素生产带来了革命性的变化。以后链霉素、金霉素、红霉素等抗生素出现，抗生素工业发展迅速。
        抗生素生产的经验也很快应用到其他药物的发酵生产，如氨基酸、维生素、甾体激素等。工业化生产的微生物药物主要为抗生素(antibiotic)、氨基酸(amino acid)、维生素(vitamin)、核苷酸和核苷 (nucleotide, nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制剂(enzyme inhibitor)、免疫调节剂(immunomodulator)和受体拮抗剂(receptor antagonist)等。

1.3.3 酶工程技术制药
       酶工程(enzyme engineering)是酶学和工程学相互结合渗透发展形成的，以应用为目的，研发新酶并生产、分离和纯化，包括酶的固定化及酶反应器及酶的分子设计等。酶工程制药的工艺结构紧凑、简单，高产、成本低，产品收率高、纯度好，可重复生产，对环境污染小。
        酶工程技术在制药工业上的主要应用是（1）生物酶用于制备手性药物。目前已有50多种有机反应可通过微生物实现，广泛应用甾体激素、氨基酸、维生素和抗生素的制药中。（2）生物转化，给已有药物添加基团，增加药效和功能。黑根霉一步生物转化孕酮为11a-羟基孕酮，实现了甾体类激素的工业化生产。（3）固定化酶技术用于制药。用固定化大肠杆菌细胞（产生青霉素酰化酶）转化青霉素G、V，除去侧链生产无侧链青霉素，即6-氨基青霉烷酸。固定化5-磷酸二酯酶水解转化酵母RNA，生产5-复合单核苷酸。固定化氨基酰化酶拆分化学合成的DL-氨基酸，产生有活性的L-氨基酸。

1.3.4 细胞培养技术制药
       动植物细胞培养(cell culture)是在离体条件下人工培养基上培养动植物细胞，使之生长繁殖并发育。细胞培养是建立在细胞学说基础之上，细胞具有全能性，即含物种所有遗传物质的细胞具有发育成为个体的潜在能力。
       最早只有从正常组织中分离的原代细胞才能用于药物生产，如鸡胚细胞和兔肾细胞。以后，二倍体的传代细胞也可以用于生产，如WI-38和2BS细胞系。在消除了人们对非二倍体细胞的疑虑和担忧后，异倍体细胞广泛应用于制药。
        动物细胞培养主要应用于生产人畜病毒疫苗、单克隆抗体、重组基因工程产品等。到目前，FDA批准了约60种动物细胞表达系统生产的生物技术药物，包括激素类、7种酶类、10种细胞因子、7种凝血因子、19种治疗性抗体、5种体内诊断用抗体。其他还有组织工程产品有4种，3种为组织工程皮肤，1种为组织工程软骨。大规模生产的疫苗有口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。目前约有70%批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造，而且数目还在不断增加。动物细胞培养制药是药物生产的一个新领域。

1.3.5 基因工程技术制药
        基因工程（gene engineering）制药是在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。通过基因工程改造微生物细胞的代谢过程，还可提高抗生素、维生素、氨基酸、核酸、辅酶、甾体激素等药物的生产能力。
      1982年世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素获得FDA批准，由Eli Lilly公司正式生产，推向市场。重组微生物、转基因动植物为药物的生产提供了强大生物反应器。人类基因组计划的完成，以及随后蛋白质组、代谢组、糖组等后基因组时代的系统生物学技术的出现与发展，为制药设计提供了更多的功能性数据，对人类战胜疾病、提高生命质量具有重大意义。
       基因工程技术首先在医药领域实现产业化，现在有60％～80％集中在医药领域，占主要地位的是基因工程药物的研究和商品化。到2004年2月，美国FDA批准的重组蛋白、核酸和疫苗类生物技术药物共79种。到2003年底，欧盟EMEA批准了49种基因重组蛋白质药物、11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。
       世界生物技术药物的销售额将以年均10％～15％速度增加，基因工程药物在药物市场中将占15％。

1.4 化学合成制药技术发展

1.4.1 全合成制药
       现代制药工业始于19世纪，染料化学工业的发展和化学治疗学说的创立，人们对大量的化工中间体和副产物进行了药理活性研究，药物合成突破了仿制和改造天然药物的范围，转向合成与天然产物完全无关的人工合成药物，如扑热息痛、磺胺类药物，开创了化学合成制药。
      20世纪初期，化学药品大多是在德国。金黄色物质、吖啶类和偶氮染料(Azodyes)抗菌活性的研究，磺胺染料的合成，理化性质和构效关系的研究，总结出了磺胺类药物的结构与抑菌活性的关系，并由此开发出了数十个临床应用的磺胺药。磺胺类药物的问世在化学合成药及其临床治疗上具有里程碑的意义，极大地推进了现代医药工业的发展。20世纪30年代以后，全合成得到大发展，激素类药物、维生素C等相继合成，实现了工业化生产。

1.4.2 半合成制药
     20世纪60年代新型半合成抗生素工业崛起，获得了青霉素的母核6-氨基青霉烷酸并研究了半合成青霉素和头孢菌素C，得到了耐酸、耐酶、对耐药菌株有效的广谱青霉素，进入了用化学方法对已有的抗生素进行化学结构改造的新时期，开辟了抗生素研制的新途径。
     20世纪70年代，随着新的有机合成试剂、新的合成技术、新的化学反应的不断得到应用，促进了药物合成的发展，使合成药物的品种和产量迅速增长，生产规模日益扩大。出现的一系列钙拮抗剂、血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂和3-羟基-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂。

      20世纪80年代，诺氟沙星（氟哌酸）正式用于临床后，引发了对喹诺酮类抗菌药的研究热潮，开发出了环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星等一系列抗菌药物。这些抗菌药和一些抗生素的成功应用，成为合成抗菌药发展史上的重要里程碑。

1.4.3 手性制药
     20世纪90年代，在世界上兴起了手性药物。由于数理科学、化学科学、生物科学、计算机科学及技术的飞速发展和相互交叉及渗透，使人们能够采用更多、更先进的手段来设计和合成新的药物，合成的新药向疗效高、毒副作用小、剂量小的方向发展。因此，采用单一对映体（即手性药物）供药成为现代医药工业的一项紧迫任务。手性药物工业是国际制药工业新兴的一个领域，它将是本世纪制药工业的一个挑战。

1.5 制药工业的发展

制药工业（pharmaceutical industry）的历史大约70多年，但一开始就发展很快，目前全世界制药企业超过10000家，生产制造5000多种药物，其中约100家为跨国公司。现代制药工业的发展可追溯到19和20世纪之交，那时只有4种药物：洋地黄用于治疗各种心血管疾病，奎宁用于治疗疟疾，吐根属植物提取物（活性成分为生物碱）用于治疗痢疾，水银用于治疗梅毒，但当时缺乏安全性和有效性。随着生物学和有机化学的发展，能人工合成某些药物，如阿司匹林，从而诞生了化学制药公司，19世纪末成立了Bayer和Hoechst公司。尽管如此，直到20世纪30年代，制药工业才开始大发展，发现并能化学合成磺胺类药物，用于治疗细菌性感染。20世纪40年代大规模生产青霉素，建立了很多现代领头制药企业，如Eli Lilly、Wellcome、Glaxo、Roche等。20世纪70年代以后，出现现代生物技术制药公司。

      世界制药行业具有以下特征。
       （1）并购风云不断，重组形成更大集团，强强联合优势互补，战略性驱动，企业经营的专业化，企业间的合作。并购数量增加，药品生产的集中度不断提高。
      （2）研发费用持续上升，投入继续增大，国际10大制药公司的年均投入占销售额的16％左右。1个新药的研发费用约8－10亿美元，但新药批准上市的数目在下降。研发的难度越来越大，新产品是行业的希望。
      （3）重磅炸弹药物数目持续增加，从1995年到2004年，增长了近4倍。跨国公司更多依赖于重磅炸弹药物，是企业的主要利润来源。      

     （4）生物技术药物异军突起。20世纪80年代以前是治疗性药物，20世纪90年代是改善生命质量的药物，而进入21世纪，将是靶向的蛋白质、多肽和核酸类治疗性药物。
       目前，全世界生物技术公司4400多家，主要集中在欧美，美国1444家，欧洲1815家，加拿大472家，亚太地区685家。年产值超过10亿美元的生物技术公司有20余家。
       美国是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家，美国70％的生物技术产品集中在生物药品。美国生物技术制药形成规模化的公司有Amgen、Biogen、Chiron、Schering-Plough、Eli Lilly、Merker、Genentech、Hoffman-La Roche、Smith Kline Beecham、Genzyme、Ortho Biotech等20余家公司，其中Genentech、Amgen、Biogen、Chiron和Genzyme的销售额在名列前茅。
     

1.5.2 中国制药工业发展
        中国制药工业的发展经历了从药店到厂房，再到现代化企业和集团的过程，由于制药行业的特点，决定了将永远是不断重组和兼并的发展过程。

      1840年鸦片战争后，西药的引入中国，制药工业逐渐发展起来。

     19世纪50年代开始建立的早期西药房，经营进口药，但未形成制药工厂或企业。清末洋务运动期间，也未见有制药厂的兴建。
     20世纪20～30年代，上海、广州是我国近代制药工业的发祥地，虽得到一定的发展，受到连年的战争和帝国主义的控制，人才匮乏、化学工业与机械工业薄弱等因素，制药工业十分落后。只有少数中小型制药厂，生产品种少。而且以制剂生产为主，原料药的制造很少。生产厂规模不大，设备简陋，资金很少，产品单一。
      1949年新中国成立初期，重视医药工业的发展，确定了“以发展原料药为主”的方针。同时，积极发展药物制剂生产。1951年试制出第一批结晶青霉素，1958年，以生产抗生素为主的华北制药厂建成投产，抗疟药物氯喹、伯喹和乙胺嘧啶相继合成并投产。1960年建成太原制药厂投产磺胺药。合霉素、氯霉素、磺胺药等原料药生产车间相继建成投产，摆脱进口局面。生化原料药胰岛素、胃蛋白酶、人造牛黄、胆固醇等相继生产。至1959年，中国建立起化学制药工业，改造、扩建和新建了一批车间和厂房。开启了中国制药的新篇章。
        20世纪60－70年代，半合成抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素的研究发展十分迅速，半合成的青霉素类品种增加到十几种。合成了很多抗疟疾药物。甾体工业已发展到相当规模，改进工艺，增加品种，提高产量。在地方病用药、抗肿瘤药物、维生素类、心血管类、神经系统药的合成研究或结构改造上都得到了很大发展。
        20世纪80年代后，走上了按正规制药工业管理和发展的道路。1984年原料药产量5.2万吨，1986年在原料药产量6.3万吨，1987 年原料药6.5万吨。1988年主要原料药产量7.18万吨，生产青霉素1700吨，1990年产量8.4万吨。

1.5.3 中国制药工业的现状
1.5.3.1 医药产业规模
        医药行业包括化学制药工业、中成药工业、中药饮片工业、生物制药工业、医疗器械工业、制药机械工业、医用材料及医疗用品制造工业、其他工业。从1996年以来，医药工业的增长速度高于GDP的增长速度。1991－1995年发展速度最快，年平均增长率为22％，1996－2000年年平均增长率17％，2001－2003年年均增长17.5%。在2004年医药行业工业总产值中，化学制药在医药工业中保持主导地位。化学制药占53.81%，中药制药占26.86%，生物制药占6.4%，医疗器械占8.32%，其他占4.62%。      

     20世纪90年代以后，中国制药行业快速发展，根据国家GMP标准对厂房进行设计和建设产品生产的专业化和先进的药物生产线。由于GMP的强行行业认证，我国制药企业数量从2001年以来呈下降趋势，2004年，化学制药企业2000家左右，其中化学原料药864家，化学制剂1057家，中药企业1000多家。
        化学原料药是中国医药行业的优势品种，中国现已成为世界原料药第二大生产国，青霉素及内酰胺类药物和维生素的最大生产国和出口国。2004年化学原料药工业总体规模世界领先，化学制药行业共实现工业总产值1929.2亿元，实现利润146.8亿元。2004年化学原料药实现工业总产值841.0亿元，同比增长12%，利润50.2亿元。2004年生物制药产业实现工业总产值271.55亿元，同比增长24%，完成销售收入248.95亿元，同比增长22.08%，创造利润25.19亿元，工业总产值及销售收入均高于医药制造业总体增长。预测在未来3至5年内，中国生物医药产业会保持25％左右速度快速增长。
           

1.5.3.2 医药产品结构
         国际制药业销售以专利药为主体，中国正处于从仿制向创新为主体转换的关键阶段。从中国医药产业的产品结构看，以占制药工业55%的化学药为例，中国具有自主知识产权的创新药仅占约3%。生产化学原料药近1500种，总产量80万吨，位居世界第2；生产化学药品制剂34个剂型、4000余个品种；现代中药剂型40多种，总产量已达37万吨，品种8000余种。生产疫苗、类毒素、抗血清、血液制品、体内外诊断试剂等各类生物制品300余种，其中现代生物工程药品20余种；能生产预防制品约9亿人/份。生产包括X射线断层扫描成像装置、磁共振装置等在内的医疗器械11000多个品种、规格；可以生产8大类1200多个规格的制药机械产品。
        2002年全国医药总产值占GDP的3.2%。中药总产值784亿元，化学药2102亿元，生物药物184亿元。化学药占行业的61％，年增长30％；中药占23％，年增长7％；生物药物占6％，年增长31％。抗生素生产企业140多家，原料药产量5万吨，制剂企业420家，产量588.9亿支/瓶/片。维生素原料药产量8.2万吨，企业50多家，制剂产量281亿支/瓶/片。氨基酸原料药7.4万吨，企业20多家，制剂产量1亿支/瓶/片。味精生产企业180多家，产量121万吨。柠檬酸生产企业100多家，产量42万吨。酶制剂生产企业200多家，产量35万吨。2002年高于医药产业平均水准的是制药机械(28％)、化学制剂(21％)；低于平均的是中药(16％)、生物制药(16％)、卫生材料(15％)、及医疗器械(12％)。
        1989年rhuIFN-α1b申报新药，1993年获得批准试生产。rhuIFN-α1b采用中国人基因克隆和表达，是我国第一个拥有自主知识产权的上市基因工程药物。p53基因药物、结合型灭活甲乙肝疫苗、流感疫苗、重组人血管内皮抑制素注射液等被SFDA相继批准。目前SFDA批准上市30种生物药物，正在中检所完成或正在进行的生物技术药物约80余种，生物技术制药的规模正在形成。

1.6 制药技术展望

制药行业是一个集约化、国际化程度极高的产业。国外公司在中国设立研发机构，并把生产制造中心向中国转移。“十一五”时期乃至更长时间我国医药市场需求将继续保持旺盛势头。中国医药市场今后5年内将以15％～20％的速度发展，到2010年将达到240亿美元，成为继美国、日本、德国和法国之后的世界第5大医药市场，2020年将达到1200亿美元，超过美国成为全球第一大市场。从制药业各子行业看，未来5～10年期间，我国医药市场将继续保持以化学药为主，生物技术制药已经成为制药行业的新领域，天然提取制药有很大发展空间。

1.6.1 创新药物研究
       加大制药的科研开发投入，研究并拥有自主知识产权的药物和技术。我国现有常用西药4 000多种，其中97％属于仿制国外产品或进口药。化学制药须从仿制变为创新，摆脱简单仿制国外产品的局面，建立新药创制和相关技术创新的机制。现代生物技术产业是全球重点发展的产业，现在是我国生物制药发展的关键时期。采用组合生物化学、生物分子芯片、细胞组织和动物模型等高通量的方法筛选天然药物，发现新型治疗药物。利用人类基因组和蛋白质组以及病原生物体的基因组的最新成果，计算机技术，把生物信息学、分子生物学、基础医药学、药物化学、药理学等的技术综合起来，通过突变、生物展示、嵌合、质谱分析等，进行新型药物的辅助设计和药物筛选，特别是蛋白质药物和核酸药物，研究并建立新型药物筛选模型及其新技术、新方法，获得创新性药物。
        通过基因工程技术，改变重组蛋白类药物的结构，如将单链变成双链和增加活性位点，从而增强活性，延长体内的半衰期，达到减小剂量和减少注射次数的目的。已上市的tPA改变成TNK-tPA，将EPO变成ARANESP，改构的重组TNF等。
       重组蛋白类药物、寡核苷酸药物、合成肽、小分子抗体等的化学修饰，改变药代动力学和生物利用度，延长半衰期，提高疗效，使之成为新一代药物。
       生物分子修饰的化学药物也获得了巨大成功，2005 年2 月获FDA 批准了American Bioscience (ABI) 公司的ABRAXANE (paclitaxel protein-bound particles for injectable suspension)，是利用人白蛋白制成的纳米颗粒结合紫杉醇注射制剂，代替了传统的紫杉醇制剂中容易引起患者过敏反应的有害溶剂，患者无需再注射肾上腺酮来防止溶剂过敏反应，大大加强了紫杉醇的临床效果和安全性。

1.6.2 抗体工程制药技术
       FDA批准上市的生物药物中，抗体类药物所占比例越来越大，2004 年有11 个，3个为全新药物，其它为新适应症。抗体类药物一上市就成为年销售额逾亿美元的重磅炸弹药 (blockbuster drug)。基于单克隆抗体的治疗剂主要的应用领域是癌症，上市的抗体药物一半都在营利。目前上市的18 mAbs，在美国有8种已达3千万美元，其中4种是重磅炸弹药物，每年获利超过10亿美元。预计单抗药物的全球销售额将从2004年的50多亿美元增至2010年的150亿美元，平均年增长30%。

1.6.3 制药工艺新技术及其改造
       应用现代科学技术改造我国传统的医药工业，使我国制药行业的经济实现由速度型向效益型、由粗放型向集约型的根本转变，用先进的制造技术进行药物生产。以生物技术等高技术为依托，开发医药产品与技术的新领域，加强生物技术制药的研究、开发和产业化，特别是下游的工艺过程，实现制药技术结构的战略转移。利用基因代谢工程技术和细胞工程原生质体融合技术，与传统生产技术相结合的方法，改造和构建抗生素、维生素、氨基酸等药物生产新菌种，提高发酵水平，降低消耗，提高生产效益。把固定化技术与生物转化相结合，研究大规模半合成抗生素的生产工艺技术，应用现代生产技术生产高效低毒的广谱抗生素。应用微生物转化法与酶固定化技术发展氨基酸工业和开发甾体激素，并对现在传统生产工艺进行改造。
       哺乳动物细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，这种局面将持续并且其所占比例有逐年扩大趋势。研究适用于大规模药物生产的动植物和微生物表达系统，提高药物生产效率的新途径。动物细胞大规模培养技术仍未很好解决，产业化困难重重。需要加大力度研究，实施产业化工程，有望解决问题。

       目前世界上正在开发的新药中，手性化合物约占70％，正在进行Ⅱ/Ⅲ期临床试验的药物中，80%为单一异构体。手性药物技术、反应合成与分离的耦合、化学与生物技术融合正成为新一代的制药技术。
       加强环境保护与质量意识。原料药的生产的主流将继续，但要抓住高端原料药的竞争。研究和推行清洁工艺，推行清洁生产，控制污染总量。提高化学药物的合成药水平，特别是提高化工中间体的合成药技术。扑热息痛(对乙酰氨基酚)年产近3万吨、出口近2万吨，以对硝基氯苯或苯酚为起始原料，工艺落后，污染重，成本高。减少消耗高、污染重、附加值低的原料药出口，增加技术含量高、附加值高的原料药和制剂出口。

2.1 微生物发酵与制药

2.1.1 微生物发酵制药
2.1.1.1 抗生素的发现
  1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际生产和应用的只有100余种。

2.1.1.2 发酵制药种类
  发酵：通过微生物的培养而获得产物的过程。常常用产物说明，冠以某某发酵，如青霉素发酵，维生素发酵等。发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。
（1）微生物菌体发酵
   微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。
（2）微生物酶发酵
   微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6－氨基青霉烷酸。
（3）微生物代谢产物发酵
   ①初级代谢产物：氨基酸，核苷酸，维生素，有机酸。
   ②次级代谢产物：最主要的是抗生素。
（4）微生物转化发酵
   利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。

2.1.1.3 制药微生物的种类
   生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）产生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacterium flarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。
   放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多，诺卡菌属较少，还有小单孢菌属。生产的抗生素主要有氨基糖苷类（链霉素、新霉素、卡那霉素等）、四环类（四环素、金霉素、土霉素等）、放线菌素类（放线菌素D）大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大环内酯类（制霉菌素、抗滴虫霉素等）。酸性、碱性和中性，但以碱性为多。
   真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类，多为酸性化合物。

2.1.2 发酵制药的基本过程
   发酵制药就是利用制药微生物，通过发酵培养，在一定条件下，生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后，从发酵液中提取分离、纯化精制，获得药品。菌株选育（mutation and selection breeding）、发酵(fermentation)和提炼(isolation and purification)是发酵制药的三个主要工段。主要过程如下。
   工艺过程包括发酵和分离纯化两个阶段。
   生产菌种选育与保存：菌种选育使青霉素的产量由最初20单位提高到80000单位以上。优良菌种应该高产、性能稳定、容易培养。
   发酵阶段包括生产菌、孢子制备、种子制备、发酵培养，是生物加工工程过程。
   孢子制备：保存的菌株，在固体培养基上，复苏，生长产生孢子。
   种子制备：将制备的孢子接到摇瓶或小发酵罐内，培养，使孢子发芽繁殖。对于大型发酵，普遍采用2次扩大培养制备种子，最后接入发酵罐。
   发酵：将种子以一定的比例接入发酵罐，培养，是生产药物的关键阶段和工序。需要通气，搅拌，维持适宜的温度和罐压。发酵一定周期。期间，取样分析，无菌检查，产量测定。加入消泡剂、酸碱控制pH，补充碳源、氮源和前体，促进产量。
   分离纯化阶段包括发酵液处理与过滤、分离提取、精制、成品检验、包装、出厂检验，是化学分离工程过程。
发酵液的预处理与过滤：使发酵液中蛋白质和杂质沉淀，增加过滤流速，使菌丝体从发酵液中分离出来。如制霉菌素、灰黄霉素、曲古霉素、球红霉素药物存在于菌丝中，要从菌体中提取。如果存在于滤液中，澄清滤液，进一步提取。
   提取与精制：吸附、沉淀、溶媒萃取、离子交换等从滤液中把药物提取出来。精制是浓缩或粗制品进一步提纯并制成产品。可重复或交叉使用四种基本方法。
成品检验：包括性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热源试验、无菌试验、酸碱度试验、效价测定、水分测定等。
   成品包装：合格成品进行包装，为原料药。制剂由制剂车间或厂再分装。

2.2 制药微生物生长与生产关系

2.2.1 制药微生物的生长特性
2.2.1.1 微生物的生长与繁殖
生长和繁殖是两个完全不同的概念。生长是细胞原生质总量或体积的增加，繁殖是细胞分裂而出现细胞数目的增加。细菌的繁殖方式是无性二等分，而放线菌则主要是通过产生无性孢子，菌丝断片也可以繁殖。霉菌以无性孢子和有性孢子及菌丝繁殖，酵母进行出芽生殖和裂殖。
2.2.1.2 微生物细胞的分化
分化是菌丝体产生不同形态类型细胞的过程，包括菌体营养细胞的分化和孢子的形成。细胞的分化受遗传性和环境因素的相互作用所控制。
2.2.2 制药微生物发酵的基本过程特征
根据菌体生长与产物生成的特征，可把发酵过程分为菌体生长期（cell growth phase）、产物合成期(product formatting phase)和菌体自溶期(cell autolysis phase)三个阶段。
2.2.2.1 菌体生长期
菌体生长期（cell growth phase）也称为发酵前期(fermentation prophase)，是指从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。菌体的主要代谢是进行碳源、氮源等分解代谢，培养基质不断被消耗，浓度减少，而菌体不断地生长和繁殖，浓度增加。溶氧量不断下降，达到菌体临界值时，溶解氧浓度降到最低。培养基的pH也随着变化，有的菌种，开始适当上升，然后下降；这是首先利用氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用，pH有下降。有的菌种，开始适当下降，然后上升。这是首先利用糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，而后又被利用所致。培养液的物质消耗或菌体浓度或溶解氧浓度达到一定水平时，其中一个参数就成为菌体生长的限制因素，菌体生长减慢。同时大量生成并积累中间代谢产物，酶受到调控，改变了代谢途径，菌体的生理状况发生改变，初级代谢转向次级代谢，由菌体生长阶段过渡到产物合成阶段。
2.2.2.2 产物合成期
产物合成期 (product synthesis phase)也称为产物分泌期(product secretion phase)或发酵中期(fermentation metaphase)，主要进行次级代谢产物或目标产物的生物合成。产物量逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。呼吸强度无明显变化，菌体在增重，但不增加数目。以菌体DNA含量作为菌体生长繁殖的标准来划分生长阶段和产物合成阶段，其界限是很明显的，即菌体生长恒定（即DNA含量达到定值）就进入产物合成阶段。以菌体干重作标准则有交叉，因为菌体数量虽无增加但多元醇、酯类等细胞内含物仍在积累，菌体干重增加。碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主。培养基质的分解代谢与产物合成代谢并重，不断分解消耗碳源、氮源等，不断合成产物。对外界变化敏感，容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。碳、氮、磷酸盐等物质必须控制在一定有效浓度范围内，否则，培养基质过剩造成菌体生长繁殖，抑制产物合成；而培养基质不足，菌体生长量少，容易衰老，合成能力也下降。发酵条件如pH、温度、溶解氧等参数也要严格控制。
2.2.2.3 菌体自溶期
菌体自溶期(cell autolysis phase)也称为发酵后期(fermentation anaphase)，菌体衰老，细胞开始自溶，氨基氮含量增加，pH上升，合成产物能力衰退，生产速率减慢。发酵必须结束，否则产物被破坏，同时菌体自溶给过滤和提取等带来困难。
2.2.3 制药微生物的生长动力学
在适宜的培养基中接入菌种，每隔一定时间取样测定细胞数目和生物量、发酵参数（培养基成分和培养条件）、产物生成等，对发酵时间作图，就得到了动力学曲线。细胞群体量随发酵时间的变化曲线为微生物生长动力学曲线。微生物生长动力学曲线描述了微生物由接种到自溶死亡整个过程。发酵过程中培养液会变粘稠，液体的流变学特性影响氧传递、热传递和混合等过程。分批式培养过程分为以下几个时期。
2.2.3.1 延迟期
延滞期（lag phase）或适应期是指接种后，菌体的生物量没有明显增加的一段时间。延迟期是菌体适应环境的过程。延迟期时间长短不一，与遗传和环境因素有关，由菌体与环境相互作用的程度决定的。因不同接种量、不同菌种和菌龄等而表现不同。工业上希望延迟期越短越好，常采用如种子罐与发酵罐培养基尽量接近，对数期的菌体作为种子、加大接种量等方法进行放大培养和发酵生产。
2.2.3.2 对数生长期
对数生长期（log phase）是菌体快速繁殖，生物量的增加呈现对数速度增长的过程。特点是生长速率达到最大值，并保持不变。细胞的化学组成与生理学性质稳定。菌体生长不受限制，细胞分裂繁殖和代谢极其旺盛。可以认为细胞组分恒定，菌体细胞的生长速率与生物量是一级动力学关系
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对数期比生长速率达到最大值，
对数期μmax是个常数，因此细胞生物量倍增时间（doubling time）可以表示为：
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不同生物由于μmax值不同，倍增时间差异很大。微生物细胞μmax较大，倍增时间约为0.5～5小时。
对于单细胞一分裂为二的基因工程菌，如细菌和酵母，细胞数目倍增时间就是世代时间，td可表示为：
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其中，t为n次分裂的总时间，Nt为n次分裂后细胞数目，N0为分裂前的细胞数目。根据对数期中一定时间内的细胞数目的变化，可求出倍增时间。
2.2.3.3 减速期
减速期(decline phase)是指菌体生长速率下降的一段时间。由培养基中基质浓度下降，有害物质积累等不利因素引起。在减速期内，生长速率与菌体浓度仍符合一级动力学关系，但受基质浓度限制。一般生物的减速期较短。
2.2.3.4 静止期
静止期或稳定期（stationary phase）是指菌体净生长速率为零的一段时间。由于营养耗竭、代谢产物或有毒害物质的积累，菌体浓度不增加，细胞的分裂与死亡同步进行，生长速率与死亡速率相等，达到平衡。符合如下方程：
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其中kd为死亡速率常数。
最大菌体浓度：
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特点：①细胞数达到最大值，②生长速率与死亡速率处于一种动态平衡，③细胞内开始积累贮存物，④大多数芽孢菌形成芽孢，⑤次级代谢产物在此阶段合成。
静止期往往是目标产物生成的主要阶段，为了延长稳定期以增加次级代谢产物的合成，产生上常常在此期进行补料培养，增加营养物质，提高产物量，如青霉素发酵时流加葡萄糖。
2.2.3.5 衰亡期
衰亡期（death phase）是指菌体死亡速率大于生长速率的一段时间。表现为细胞自溶、死亡加速，细胞浓度迅速下降。菌体死亡速率也符合一级动力学：
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特点：①死亡速率迅速增加，②细胞数量显著下降，③细胞产生多种形态，如原生质体凝聚，形成菌丝片段。对于分批发酵培养，大多数在衰亡期到来前结束发酵，进行放罐。
2.2.4 基质利用的动力学
在菌体的生长过程，随着基质逐渐被吸收利用，基质浓度呈现降低。
基质浓度的减少可用基质消耗速率（rs）和比消耗速率（qs）表示
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    ；
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比消耗速率表示基质被利用的效率，可用于不同微生物之间的发酵效率的比较。
限制性基质浓度与比生长速率的关系与酶促反应的Michaelis-Menten方程非常相似，可用Monod方程表示：
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其中μmax为限制性基质过量时的最大比生长速率，Ks 为饱和常数，相当于1/2最大比生长速率时的基质浓度。
从方程可见，在S很低时，可以近似认为Ks + S＝Ks，则μ =μmax S/Ks，表明基质浓度与比生长速率成正比。在S很高时，可以近似认为Ks + S＝S，则μ =μmax，表明在高基质浓度下，菌体能以最大比生长速率进行生长。
μmax意义在于各种基质对菌体的生长效率，可用于不同基质之间的比较。Ks意义在于菌体对基质的亲和力，Ks越小，亲和力越大，即越能被菌体良好利用。
2.2.5 生长与产物的关系模型
从菌体生长、能源利用和产物生成速度的变化及其之间的动力学关系出发，Gaden把发酵过程分为三种模型。
I型：菌体生长与产物生成偶联型(coupling model)。菌体的生长与产物生成直接关联，生长期与生产期是一致的。产物往往是初级代谢的直接产物，菌体生长、糖的分解代谢、能源利用和产物形成几乎平行，生长期与生产期是一致的，菌体生长期和产物形成不是分开的。细胞生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，都有最大值，出现的时间接近。组成型表达的基因工程菌的产物生成属于此类型，蛋白质产物是细胞能量代谢的结果。乳酸、醋酸等初级分解代谢产物的生成也属于此类型。所以产物生成速率和比速率分别为：
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II型：菌体生长与产物生成半偶联型（semi-coupling model）。该模型介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。产物来自能量代谢所用的基质，但是在次级代谢与初级代谢分开的。在细胞生长期内，基本无产物生成，在生长的中后期生成大量的产物而进入产物形成期。分批发酵出现两个高峰，先是基质消耗和菌体生长的高峰，然后是产物形成的高峰。如柠檬酸和某些氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物也属于此类型。产物生成速率和比速率分别为：
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  ；
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其中α、β为常数。
III型：菌体生长与产物生成非偶联型（non-coupling model）。菌体生长期与产物生成期为独立的两个阶段，先形成物质消耗和菌体生长高峰，几乎没有或很少有产物生成，然后进入菌体生长静止期，产物大量生成，并出现产物高峰。产物可能来自于中间代谢途径，而不是分解代谢过程，物质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢途径，初级代谢与产物形成是完全分开的，如抗生素、生物碱、微生物毒素的发酵。对于诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录和产物表达，所以产物生成速率和比速率分别为：
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；
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2.2.6 代谢产物的生物合成
代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。代谢分为分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)，前者是指把大分子降解为小分子的过程，为合成代谢提供能量和原料；而后者是指把小分子合成为复杂大分子的过程，满足细胞生长和分化的需要。
初级代谢是营养物质转变为细胞结构物质和对细胞具有生理活性作用的物质，为细胞提供能量、合成中间体及其生物大分子的代谢网络。在初级代谢过程中形成的产物为初级代谢产物（primary metabolite），包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。几乎所有生物的初级代谢基本相同。
次级代谢存在于某些生物中，并在一定时期表达。次级代谢对正常的生长可能不必要，但对抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意义。
2.2.6.1 次级代谢产物生物合成的基本特征
（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、环肽等键。
（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化合物。
（3）生长期转向生产期，形态与生理发生变化。次级代谢产物是在细胞生长后期开始形成，当生长受限制时被启动。完成菌体营养生长期（trophophase）之后，出现次级代谢物合成期（idiophase），其生物合成比生长对环境更敏感，要求更高。次级代谢产物是以初级代谢产物为前体，受到初级代谢的调节。可能是缺乏某种营养成分，菌体生长抑制，启动了次级代谢物合成。菌体内中间代谢物积累，抑制了初级代谢酶，使之消失或活性下降，诱导了新酶的出现，转入生产期。芽孢杆菌形成芽孢，放线菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是细胞分化的伴随现象。
（4）次级代谢产物是结构相似的一组混合物，但活性差异较大。参与反应的酶的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上的初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，并继续对该产物进行修饰生成多种衍生物。一种次级代谢产物可由两种或两种以上代谢途径合成。
（5）次级代谢产物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色体外，还有细胞质遗传物质，可能存在于质粒、线粒体基因。遗传物质的变异和丢失是导致菌种退化和生产不稳定的重要因素，所以具有代谢不稳定性。
2.2.6.2 次级代谢产物的构建单位
微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初级代谢产物合成。
把构成次级代谢产物的基本结构单位称为生源（biogen）。生源直接或间接来源于次级代谢过程的中间产物或初级代谢产物。构建单位包括聚酮体、甲羟戊酸、糖类、不常见的氨基酸（如D－氨基酸、β－氨基酸等）、环多醇和氨基环多醇等。
（1）聚酮体（polyketide）
是含有多羰基的聚合物。许多抗生素如四环素类、大环内酯类、蒽环类抗生素的前体是聚酮体，构成聚酮体的前体与脂肪酸合成的前体相似，基本单位为乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸，起始单位为乙酰CoA、丙酰CoA、丙二酰CoA、丁酰CoA等，分别供给2、3、4 C单位。经过缩合、脱羧、还原、脱水，每次延长2－3个碳单位，形成多酮次甲基链。再还原后形成多种聚酮体。重复脱水得到四环素和蒽环抗生素的母核，环化后形成大环内酯结构。如果内酯环的不饱和链较多，则形成多烯大环内酯。
（2）糖类
主要有氨基糖、糖胺、核糖、环多醇和氨基环多醇等，形成抗生素有氨基糖苷类抗生素，如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素等。葡萄糖活化成酮糖，在转氨酶作用下形成氨基糖。含有氨基糖的抗生素有新霉素B、多烯大环内酯类，含有糖胺的有大环内酯、氨基糖苷类的链霉素等。它们的共同前体是葡萄糖。氨基糖是以葡萄糖为前体，合成己酮糖，再经过转氨作用，将氨基转移到糖分子上。环多醇和氨基环多醇是葡萄糖酸化、环化及氨基化反应的结果，形成氨基环醇类抗生素。
（3）不常见的氨基酸
不常见的氨基酸是指非蛋白质组成氨基酸，包括D-氨基酸、N-、β-甲基氨基酸、β-氨基酸、亚氨基酸等，如D-谷氨酸、D-苯氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-鸟氨酸、异丝氨酸、异酪氨酸、肌氨酸、α-氨基己二酸等。这些氨基酸是正常氨基酸通过异构、消旋、修饰而形成的。一些是初级代谢产物。不常见氨基酸是肽类抗生素的构建单位，如杆菌肽、放线菌素D、环孢菌素A等。青霉素、头孢菌素等生物合成也是利用非蛋白质氨基酸。
（4）莽草酸
莽草酸是芳香族氨基酸、肉桂酸、多酚化合物的前体。由葡萄糖初级代谢生成阿拉伯庚酮糖酸磷酸，脱磷酸、环化形成苯环，再脱水、加氢形成莽草酸。
（5）甲羟戊酸
甲羟戊酸是异戊二烯类、萜类化合物的构建单位，通过乙酸代谢生成。2分子乙酰CoA缩合，生成乙酰乙酰CoA，再与乙酰CoA缩合，生成3-羟基3-甲基戊二酰CoA，再还原生成甲羟戊酸。磷酸化形成活性形式异戊二烯焦磷酸，用于合成生物碱、甾醇和胡萝卜素等药物的生物合成。
非核酸嘌呤和嘧啶碱是核苷类抗生素的构建单位，是正常碱基的化学修饰形成。
2.2.6.3 次级代谢产物的生物合成的基本过程
次级代谢产物的合成基本过程包括构建单位的聚合—再修饰—装配。在此过程中，次级代谢产物的累积受合成途径中某些酶活性的限制，这些关键酶活性大小与产量正相关。
（1）前体聚合
微生物合成生源后，通过缩合反应形成聚酮体、寡肽、聚乙烯等。
各种聚酮体的合成过程相似，只是起始单位和延长单位不同。聚酮体是2－6个二碳单位的聚合反应的结果，酮基被保留，或只是还原为羟基。聚酮体可直接形成环，如四环素类和大环内酯类。进而被修饰，与相应基团如氨基糖、糖胺等结合，形成结构和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再与8个丙二酰单位缩合形成9酮化合物，再转化为中间体三环化合物。甲基化、还原、脱水、加氢、氧化形成4氧脱水四环素，加氯形成4氧脱水氯四环素，转氨形成4氨基脱水氯四环素，再甲基化形成脱水氯四环素，脱氢氯四环素，最后形成氯四环素。大环内酯是2－4碳单位缩合而成。
氨基酸的聚合有三种形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化缩合，如谷胱甘肽；蛋白质的核糖体模板合成途径；多酶复合物将氨基酸活化后，按硫模板或非核糖体机理缩合，形成肽链。氨基酸与ATP反应，在羧基上形成腺苷单磷酸酯被激活。氨基酸被转移到酶的巯基上，形成硫酯键。硫酯键断裂，提高能量，使2个氨基酸之间形成肽键（羧基与氨基结合）。依次，形成多肽链。如短杆菌肽S是由2条5肽首尾连接而成。
（2）结构修饰
包括糖基化、酰基化、甲基化、羟基化、氨基化、氧化还原等，使抗生素产生了共存的系列类似物。在聚酮体链延长的过程中，伴随许多基团的化学修饰，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷键与糖类物质连接，酰胺键与氨基酸连接，形成各种抗生素。如四环素类，先形成聚酮体，在C7位发生氯化则是金霉素，在C5位上先氧化后还原则是土霉素。
（3）装配
合成各个组分后，需要按一定顺序在特异酶作用下组装，才能形成有活性的药物。

2.3 制药微生物菌种的建立

发酵生产药物，需产量高的菌种，自然界中的菌种趋向于快速生长和繁殖，而发酵工业需要大量积累产物，因此菌种选育很重要。常规方法是利用天然变异，从中选择优良株系。随后物理因子（紫外线、X射线、中子、激光等）和化学因子（烷化剂、碱基类似物等）和生物因子（噬菌体、抗生素）诱变育种。20世纪80年代，以原生质体融合的杂交育种和基因工程育种，90年代以后，可以用基因组shuffling育种。

2.3.1 新药生产菌的选育
2.3.1.1 自然分离
（1）样品的采集与处理
从大陆土壤、海洋水体等环境中采集样品，表层土壤（0－10cm），海洋（0－100m）。根据分离目的和微生物的特性预处理。较高温度（40－120℃）处理几十分钟至几小时，甚至几天，可分离到不同种类的放线菌。化学试剂如SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。
（2）分离方法
选择适宜的培养基，满足微生物营养需要和pH条件，添加抑制剂，有利于富集。加入抗真菌试剂和抗细菌抗生素，可以富集放线菌。
分离方法有稀释法和滤膜法。用无菌水、生理盐水、缓冲液等稀释后，涂布平板。用0.22－0.45 μm培养，细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。放线菌可在25－30℃、32－37℃或45－50℃下培养，7－14天至1月。
（3）活性测定
非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。可以使用耐药和超敏菌种。用HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。

2.3.1.2 自然选育
在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫自然选育或自然分离。自然选育的常用方法是单菌落分离，需要反复筛选，确定生产能力比原菌株高的菌种。基本过程如下：
菌种→单孢子或单细胞悬液→适当稀释→琼脂平板分离→挑单个菌落进行生产能力测定→选出优良菌株。
自然选育简单易行，可达到纯化菌种、防止退化、稳定生产水平和提高产量的目的。但效率低，增产幅度不会很大。
2.3.1.3 诱变育种
诱变育种是人为创造条件，使菌种发生变异，从中筛选优良个体，淘汰劣质个体，当前菌种选育的一种主要方法。其特点是速度快、收效大、方法相对简单。但缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。
（1）诱变剂
诱发突变的因素有物理、化学和生物三类。物理因素包括各种射线，紫外线、快中子、X射线、R射线、激光、太空射线等。化学因素包括碱基类似物，2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等；与碱基发生反应的物质，硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥、羟胺等；DNA嵌合剂，丫啶类，溴化乙锭等。生物因素包括噬菌体、质粒等。这些因素最终使遗传物质DNA的一级结构发生变化，从而导致性状变异。
（2）诱变育种方案的设计
诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是不断多轮重复。首先制定诱变方案，进行诱变实验。选择好出发菌株（starting strain），产量较高，对诱变剂敏感。进行诱变处理，交叉使用多种诱变剂比一种效果更好，对诱变剂进行合理组合。根据致死率和诱异率，确定适宜的诱变剂量。最好是既能增加变异范围，又有大量的正向变异。其次，确定筛选目标和方案，进行筛选。除高产外，还有生长速度快，产孢子多，有效利用廉价碳源等。筛选应该施加一定的选择压力（selective pressure），如抗生素、基质浓度等，或生理作用，有针对性进行。

2.3.1.4 杂交育种
杂交育种是两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选具有新性状的菌株。带有定向育种的性质。
方法1：接合（conjuction）
直接混合培养两个菌种，通过接合而形成异核体（heterocaryon, 菌丝中含有遗传特性不同的细胞核），进而产生分生孢子。个别细胞核发生融合，得到杂合二倍体，极少数发生染色体交换，得到重组型二倍体，进而筛选得到高产菌株。
方法2：原生质体融合(protoplast fusion)
用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。
原生质体融合育种首先要建立细胞再生体系，这样保证了融合后的原生质的有效再生。一般要求两个亲本菌种具有明显的遗传标记，便于融合后的有效筛选。除了PEG化学促进融合外，还有电融合等其他物理方法，融合效果都很好，但需要相应的仪器。链霉菌的原生质体融合的基因组重组率高达20％。最近，基于原生质体融合的基因组shuffling是细菌单染色体细胞的有效育种方法，属于分子定向化育种范畴。

2.3.1.5 基因工程技术育种
采用基因工程技术即基因克隆与表达技术，过量表达或抑制表达某一个或一组基因，调控代谢过程，实现目标产物的高效表达。一般希望外源基因整合到染色体中，以便稳定遗传。在传统抗生素、氨基酸、维生素发酵的育种中具有重要意义。

2.3.1.6 基因组shuffling技术
DNA shuffling（重排，改组，重洗） 又称有性PCR(sexual PCR)，是一个反复突变和重组的循环过程，从一组相关基因的随机片段（来自不同种类生物，具有相关功能的基因），通过无引物PCR的方式重新组合，装配新功能重组（recombination）基因，生产有用或有潜力的新基因产品。这些基因，再次被酶切成片断，再一次重组成新的组合基因，此过程一再重复，一直到具有高品质的蛋白质产生。
基因组shuffling与DNA shuffling类似，c作对象为单染色体组成的基因组。原生质体融合时，基因组发生重组形成突变候选库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌株，即经济适用的菌株。以前的随机突变和选择（至少10－20轮）为工业微生物筛选了优良菌株，但对表型改进仍然困难，因为表型是由分布在基因组中的一批基因决定。基本过程如下：
（1）随机突变获得单个性状优良的菌株
（2）多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）
（3）再次重复循环融合，得到融合库F2、F3、F4
（4）筛选鉴定
基因组shuffling的关键是起始突变体的选择、遗传重组的效率、选择方法的灵敏性。已经在泰乐霉素生产菌的改造、蛋氨酸生物合成途径的进化等方面取得明显效果。

2.3.2 菌种保存
目的：保持长期存活、不退化、不丧失生产能力。
保存原理：使其代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态，可保持原有特性，延长生命时限。

2.3.2.1 斜面低温保存
也称定期移植保存，可用于生产菌种的短期保存。利用低温降低菌体的新陈代谢，使菌种的特性在短时间内保持不变。菌种接在适宜的平板培养基上或斜面试管中，在生长温度下，生长至旺盛期，然后置于低温冰箱内，一般4℃，湿度小于70％，进行保存，每隔一定时间移植转移一次。该方法的优点是c作方便，使用便利，缺点是保存时间短，容易发生变异。

2.3.2.2 液体石蜡密封存保藏
生长好的斜面菌种或穿刺培养物，加入灭菌的液体中性石蜡油，覆盖厚度1cm左右，封闭管口，然后置于4℃低温下保存，约1年。石蜡封存，可减少水分蒸发并隔绝了氧气，增加了保存时间。但该方法不适于能利用石蜡油的菌种。

2.3.2.3 砂土管保藏
黄砂：泥土＝3：2或1：1，灭菌并无菌检查后与孢子混合，使孢子吸附在砂土上。置于干燥管中，真空泵抽气干燥后，使砂土外形松散。置于干燥器中，冰箱低温下保存，可达一年以上。对分生孢子霉菌、放线菌和芽孢细菌，可保存5－10年。只适宜于有孢子或芽孢的菌种，不适用于只有菌丝的真菌和无芽孢的细菌和酵母保存。砂土起保存载体的作用。硅胶、滤纸、瓷珠等可用于保存。

2.3.2.4 冷冻干燥保藏
生长好的菌体与细胞保护剂（脱脂奶或血清等，见表）混合，制成菌悬液在－35℃～－45℃（酒精或干冰）下预冻15分钟至2小时，使细胞快速冻结而不受破坏，保持细胞的完整性。然后低温真空干燥。封瓶后，低温避光保存。保护剂的作用在于降低细胞的冰点，减少冰晶对细胞的伤害，有利于菌体的复苏。冷冻干燥保存时间长，一般5～10年，多达15年。

2.3.2.5 液氮低温保藏
菌体培养物，加入细胞冷冻保护剂5～10％甘油和二甲基亚砜（DMSO）制成孢子或菌悬液，浓度一般大于108个/ml。分装于小的安瓿瓶或聚丙烯小管后，密封。先降至0℃，再以每分钟降1℃的速度，一直降至－35℃，然后放液氮罐中保存。也可直接置于液氮中速冻，然后在液氮中保存或在－80℃冰箱中保存，是目前最可靠的一种长期保存方法。保护剂的作用在于降低细胞的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。

2.3.3 菌种保存机构
2.3.3.1 中国典型培养物保藏中心
中国典型培养物保藏中心：China Center for Type Culture Collection (CCTCC)，(武汉大学保藏中心)。
2.3.3.2 中国科学院典型培养物保藏委员会
中国普通微生物菌种保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)
中国工业微生物菌种保藏管理中心：China Center of Industrial Culture Collection（CICC）
抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：
中国医学微生物菌种保藏中心：National Center for Medical Culture Collection (Bacteria)，CMCC

2.3.3.3 国外主要保藏机构
WFCC：World federation for culture collections, [url]http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml[/url]
ATCC: American Type Culture Collection, [url]http://www.atcc.org/[/url]
IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan
NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK

2.4 培养基制备

培养基（medium）是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。

2.4.1 培养基的成分
2.4.1.1 碳源
凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。包括糖类、醇类、脂肪、有机酸等。糖类有单糖（葡萄糖，果糖）、双糖（蔗糖、乳糖）、多糖（淀粉、糊精），常用葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜。糖蜜是制糖的副产物，主要成分为蔗糖，是价廉物美的碳源。脂肪有豆油、棉籽油和猪油，醇类有甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇，长链碳氢化合物以石油产品的正烷烃，14-18碳的混合物。以脂肪作为碳源时，必须提供足够的氧气，否则会引起有机酸积累。
2.4.1.2 氮源
凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源。可分为有机氮源和无机氮源两类。常用有机氮源有黄豆饼粉（最常用）、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素等。有机氮源含有丰富的蛋白质、多肽和氨基酸，水解后提供了主要的氨基酸来源。同时，含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素、某些生长因子等，微生物生长更好。此外，含有代谢的前体，有利于产物的生成。
常用无机氮源有铵盐、氨水和硝酸盐。铵盐中的氮可被菌体直接利用。硝酸盐中的氮必须还原为氨才可利用。无机氮源可以作为主要氮源或辅助氮源，氨盐比硝酸盐更快被利用。
根据氨盐利用后，残留物质的性质，把无机氮源可分为生理酸性物质和生理碱性物质。生理酸性物质是代谢后能产生酸性物质，如(NH4)2SO4利用后，产生硫酸。生理碱性物质是代谢后能产生碱性物质，如硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。生产中常常加入无机氮源来调节pH值，一举两得。

2.4.1.3 无机盐和微量元素
无机盐（mineral salt）和微量元素(trace element, microelement)是生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷（核酸）、硫、铁（细胞色素）、镁、钙（调节细胞膜透性）、锰、铜、锌（辅酶或激活剂）、钴、钾、钠（调节渗透压）、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。各种盐成分的使用浓度见表。
生物对磷酸盐的需要量较大，但在不同阶段是不同的。微生物生长的磷酸盐对次级代谢产物合成有重要影响。对抗生素发酵，采用生产亚适量（对菌体生长不是最适合但又不影响其生长的量）的磷酸盐浓度。
对于特殊的菌株和产物，不同的元素具有独特作用，铜能促进谷氨酸发酵，锰能促进芽孢杆菌合成杆菌肽，氯离子促进金霉素链霉菌合成四环素。钴是维生素B12的组成元素。加入微量钴，促进VB12产量，也能增加链霉素、庆大霉素的产量。

2.4.1.4 水
菌体细胞的主要成分，营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。

2.4.1.5 生长因子
生长因子（growth factor）是指微生物生长不可缺少的微量有机物，包括氨基酸、维生素、核苷酸、脂肪酸等。一般天然成分中含有，无需添加。但对于营养缺陷型（氨基酸、核苷酸）菌株，必需添加。

2.4.1.6 前体与促进剂
前体是加入到发酵培养基中的某些化合物，能被直接参与产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生多大的变化。前体明显提高产品产量和质量，一定条件下还能控制菌体合成代谢产物的方向。前体不仅有毒性，而且被菌体分解，因此多次少量流加工艺。
在抗生素等次级代谢产物的发酵中，经常添加前体(precursor)和促进剂(accelerant)，以提高产量。前体可以是产物的中间体，也可以是其中的一部分。

2.4.1.7 消沫剂
消除泡沫，防止逃液和染菌。一般为动植物油脂和高分子化合物。

2.4.2 培养基的种类
培养基的种类繁多，按组成、状态、用途分类。
按组成分类：合成培养基(synthesized medium)，成分明确。天然培养基(natural medium)，成分不完全明确，有一些天然物质。半合成培养基(semi-synthesized medium)，用途分为选择性培养基(selective medium)、鉴别性培养基(identification medium)、富营养培养基(nutrient medium)等，
按物理性质分类：固体培养基(solid medium)，半固体培养基(semisolid medium)，液体培养基(liquid medium)。
按发酵过程中所处位置和作用分为以下几类。

2.4.2.1 斜面或平板固体培养基
斜面固体培养基（solid medium）包括细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。在液体培养基添加1.0％～2.0%的琼脂粉（agar）制成固体培养基。作用是提供菌体的生长繁殖，形成孢子。特点是菌体生长迅速，产生优质大量的孢子，但不能引起变异，营养丰富。单细胞培养基要含有生长繁殖的各类营养物质，包括添加微量元素、生长因子等。丝状菌的孢子培养基，基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。

2.4.2.2 种子培养基
种子培养基（seed medium）是供孢子发芽和菌体生长繁殖，包括摇瓶和一二级种子罐培养基，为液体培养基。作用是使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子。培养基成分必需完全，营养丰富，含有容易利用的碳、氮源和无机盐等，但总体浓度不宜高。孢子发芽快，细胞生长迅速，能繁殖大量的菌体，菌体健壮，提高各种代谢酶活力。由于生长时间较短，生长快速，为了缩短发酵的停滞期，种子培养基要与发酵培养基相适应，成分应与发酵培养基的主要成分接近，不能差异太大。

2.4.2.3 发酵培养基
  发酵培养基(fermentation medium)是提供微生物进行目标产物的发酵生产，不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。要求是接种后菌体能迅速生长到一定密度或浓度，又能合成目标产物。营养物质浓度要高些，在组成上，不仅要有满足菌体生长所需的物质，还要有特定的元素、前体、诱导物和促进剂等对产物合成有利的物质。不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很大。供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用，组成应丰富完整，营养成分浓度和粘度适中。

2.4.2.4 补料培养基
补料培养基(fed medium)是发酵过程中添加的培养基。为了工艺条件稳定，有利于微生物的生长和代谢，延长发酵周期，提高目标产物产量，经常采用前期培养基稀薄一些，从一定时间开始，间歇或连续补加各种必要的营养物质，如碳源、氮源、前体等。补料培养基一般按单一成分配制，在发酵过程中各自独立控制加入，或按一定比例制成复合补料培养基，再加入。
还有一些特殊用途的培养基，如分离纯化培养基、原生质体再生培养基、鉴别培养基、生物检测培养基（测定抗生素生物效价）。

2.4.3 影响培养基质量的因素
对于发酵过程首先要选择合适的培养基。培养基的组成和配比是否恰当对菌体的生长、产物的生成、提取工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大的影响。培养基都是由水、碳源、氮源、无机盐等组成，具有一定pH和渗透压。对某一菌种和产品而言，究竟用哪些原料作培养基还需经过一系列实验的摸索才能确定一种既有利于基因工程菌生长又能保证得到高产优质产品的较为理想的培养基配方。另外，工业生产培养基所用的原材料还必须来源丰富、价格低廉、质量稳定。当然，一种好的培养基配方还应随菌种的改良、发酵控制条件和发酵设备的变化而作相应的变化。

2.4.3.1 原料质量
培养基所用原料主要为复合大分子化合物，如玉米奖、黄豆饼粉、花生饼粉、淀粉等农副产品和蛋白胨、酵母粉等，常常因加工原材料的品种、产地、加工方法、贮存条件不同而质量差异较大。化学原料如各种无机盐类化合物，杂质含量也不相同，其纯度对培养基的质量也会造成影响。
培养基原料的选择应注意碳源和氮源种类和数量的影响。虽然大多数碳源对菌种生长的能力相似，不同碳源对菌种生长的能力和产物的生产能力很不相同，对产物的生成影响很大。碳源过多，有机酸形成多，容易引起pH降低；碳源过少，引起菌体衰老和自溶。选择氮源也很重要，不同微生物对最适氮源的要求不同。同时要注意碳氮配比，氮源过多，会使营养生长过旺，pH偏高，不利于产物的积累；反之，氮源不足，菌体量生长少，也会影响产物生产。速效和缓效成分相互配合，发挥综合优势。不同生长阶段，对碳氮源的要求也不不同，要根据微生物菌种来确定。微生物对pH的要求在于，处于一定酸碱环境下，才能生长发育和生存。配制培养基时可加入酸碱性物质搭配，在生长过程中，根据工艺和设备，控制在最适范围之内。
对原料要试验选择，一旦选定后，不宜随意更换，保持稳定原料来源。在更换原料时，必需进行一系列试验，确保产量和质量的控制和稳定性。

2.4.3.2 水质
深井水、自来水、地表水、蒸馏水。水是培养基的主要成分，恒定水源和恒定的水质很重要。水质的主要参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物特别是重金属的种类和含量。优良基因工程菌有时不能高产，可能是劣质水造成的，生产中要注意。对水质定期化验检查，使用符合要求的水质配制各种培养基。菌种和种子培养基可以用蒸馏水，而生产用水必需使用超纯水，可避免相应的污染。

2.4.3.3 灭菌的影响
高压蒸汽灭菌是生产中常用方法，但控制不当，很容易直接影响培养基的有效成分甚至是活性。较高温度下长时间灭菌，营养成分会破坏，甚至产生有毒物质。磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀或络合物，降低了对磷酸和铵离子的利用。维生素、激素等在高温下被分解破坏、失活。应该将糖与其他组分分开灭菌。有研究显示糖类单独湿热灭菌，基本消除焦化现象。在能达到完全灭菌的情况下，采用高温快速灭菌是有效的措施。
灭菌会引起培养基的pH变化。一般情况下，灭菌会使LB培养基的pH增加0.1～0.2,糖类灭菌造成的酸化也很严重。

2.4.3.4 培养基的黏度
培养基中的固体不溶性成分，如淀粉、黄豆粉等增加了培养基的黏度，不仅影响发酵的通气搅拌等物理过程，而且直接影响菌体对营养的利用，也给目标产物的分离提取造成困难。高黏度的培养基，也不易彻底灭菌。生产中可用精料发酵、基础原料用酶水解，降低大分子物质，或补加灭菌水，来降低黏度。

2.4.4 发酵培养基的配制
2.4.4.1 一般原则
（1）生物学原则：根据不同微生物的营养和反应需求，设计培养基。营养物质组成较丰富，浓度适当，满足菌体生长和合成产物的需求。各种成分之间比例恰当，特别是有机氮和无机氮源，C/N比。一定条件下，各种原材料之间不能产生化学反应。具有适宜的pH和渗透压。
（2）工艺原则：不影响通气和搅拌，又不影响产物的分离精制和废物处理，过程容易控制。
（3）低成本原则：原材料要因地制宜，来源方便，丰富，质量稳定，质优价廉，成本低。
（4）高效经济原则：生产安全，环境保护，高质量，最高得率，最小副产物。
2.4.4.2 培养基的设计基本思路
（1）根据他人的经验和成分，初步确定培养基的成分，作为研究的起始培养基。
（2）单因素实验，确定最适宜的培养基成分。
（3）多因素实验，进行各成分之间浓度优化和最佳配比。如均匀设计、正交实验和响应面分析等统计学方法。
（4）从摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。
（5）综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。
2.4.4.3 理论计算与定量配制
微生物生长和生产可用下列表达式表示：
碳源和能源＋氮源＋其他营养物质→细胞＋产物＋CO2＋H2O＋热量
如果能进行定量表达，就可计算得到一定细胞生物量所需最小的营养物质。如果已知生物量与产物之间的特殊表达关系，就可以计算获得一定产量的最小底物浓度。可参考微生物的化学元素组成（表），做初步计算培养基配方。由于培养基成分的复杂性和所起作用的差异，一般针对碳源和氮源进行转化率计算和分析。
转化率是单位质量的原料生产的产物量或细胞量。理论转化率是理想状态下，根据代谢途径的物料衡算结果，而实际转化率是发酵过程中实际测量得到的数值。所以理论转化率高于实际转化率，而使实际转化率靠近理论转化率是发酵控制的最终目标。理论衡算是建立代谢过程非常清楚的基础之上，但很困难，所以对代谢过程简化后，可以定量计算。
工业生产用培养基的确定需要大量细致和周密的试验研究。目前还无法从生化反应的基本原理来推断和计算出最佳培养基配方，只能根据生理学和生物化学的基本理论，参照前人所用的经验培养基，结合生物学和产品特征要求，对培养基的成分进行深入试验。

2.5 灭菌工艺

杂菌（contaminated microbe）：对于发酵生产过程，除生产菌以外的任何生物微生物。
污染（contamination）：感染杂菌的发酵体系。
污染的后果：杂菌不仅消耗营养物质，干扰发酵过程，改变培养条件，引起溶解氧和培养基黏度降低等变化；还会分泌一些有毒物质，抑制生产菌生长；杂菌分泌酶，分解目标产物或使之失活，产量大幅度下降；噬菌体（phage）的污染引起溶菌；杂菌污染直接影响后续工序的有效进行，甚至是产品的质量。
消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭或清除病原微生物（pathogen），达到无害化程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽孢体，杀灭率99.9%以上。
杀菌：杀灭或清除病所有微生物的过程，杀灭率99.9999%以上。
灭菌（sterilization）：是指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程，达到无活微生物存在的过程，微生物杀灭率99.999999%以上。
灭菌是十分重要的工序，包括培养基、发酵设备及局部空间的彻底灭菌、通入空气的净化除菌。常用的灭菌方法主要有化学灭菌、物理灭菌两类。

2.5.1 常用灭菌方法与原理
2.5.1.1 化学灭菌
化学灭菌是指用化学物质杀灭生物细胞的灭菌c作。常用化学灭菌剂有氧化剂类如高锰酸钾、过氧化氢等，卤化物类如漂白粉、氯气等，有机化合物如70％～75％乙醇、甲醛、戊二醛、环氧乙烷、2％新洁尔灭、3%～5％石炭酸等。使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。化学灭菌主要适合用于皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及局部空间或某些器械的消毒。

2.5.1.2 辐射灭菌
物理灭菌包括使用各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌，效果好，c作方便，广泛使用。各种物理射线对生物细胞具有杀伤能力，其中以紫外线最常用。原理在于核酸和蛋白质在紫外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞死亡。但紫外线穿透力极低，只适宜于表面灭菌，常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、超净工作台等的灭菌。

2.5.1.3 干热灭菌
在高温120℃以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，内容物释放，生物体死亡。对于干热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都可以杀灭生物体。干热灭菌效果没有湿热灭菌好，是实验室常用的器皿的方法。工业采用160℃、2h，或170℃、1h干热空气，用于需保持干燥的器械、容器的灭菌。温度越高，时间相应缩短。

2.5.1.4 蒸汽灭菌
湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下，穿透力强，蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体死亡。一般在115℃～140℃，保持一段时间，可以杀死各种生物体。由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，c作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭菌。常用条件为115℃～121℃，压力1×105Pa，维持15～30分钟。芽孢是一种休眠体，外面有厚膜包裹，耐热性很强，不易杀灭。因此在设计灭菌c作时，经常以杀死芽孢的温度和时间为指标。为了确保彻底灭菌，实际c作中往往增加50％的保险系数。
灭菌过程中，高温会使营养成分受到一定程度破坏。灭菌活化能大大高于营养物质分解活化能，因此应尽量减少灭菌时间和温度。从微生物死亡动力学方程可以看出，随着温度的升高，微生物的死亡速率加快，而且比营养物质分解速率快得多，因此高温短时灭菌可达到相同灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。这就是高温短时灭菌的理论基础。实践证明，在能达到完全灭菌的情况下，采用高温短时灭菌是有效的措施。
培养基的pH、原料成分及泡沫对蒸汽灭菌效果有一定影响。不同原料所含杂菌数量不同，pH在6～8内，蛋白质、糖、油脂等物质的存在，对微生物起包裹作用，使微生物对热的抗性增加，不易死亡。pH在6.0以下，微生物对热较敏感，容易杀死，低pH下灭菌时间可缩短。颗粒的存在容易形成灭菌的死角，泡沫的c作阻碍了蒸汽的流动，并形成隔热层，灭菌效果大大降低。这些因素在灭菌c作中应该予以重视。

2.5.1.5 培养基的过滤除菌
有些培养基成分受热容易分解破坏，不能使用蒸汽灭菌，常常采用过滤器除菌。常见的有蔡氏细菌过滤器、烧结玻璃细菌过滤器和纤维素微孔过滤器等。蔡氏细菌过滤器采用石棉滤板，烧结玻璃细菌过滤器的除菌用规格为小孔径的烧结玻璃。纤维素微孔滤膜有醋酸纤维素和混合纤维素等几种质地，具有一定的热稳定性和化学稳定性，孔径规格为0.1～5μm不等，一般选用0.22μm，进行溶液过滤除菌。

2.5.2 培养基的灭菌
2.5.2.1 分批灭菌c作
将配制好的培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。特点是不需其他的附属设备，c作简便，国内外常用。缺点是加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失，罐利用低。为中小型生产企业采用。
使物料溶胀并均匀受热，至90℃以上，通入蒸汽，达到121℃开始计算维持时间，生产中习惯采用30分钟。快速冷却，以减少营养物质的破坏，灭菌结束时，立即通入无菌空气，以维持罐压，然后开启冷却系统进行冷却。
灭菌时间计算
分批灭菌时间包括加热升温、保温和降温冷却三个阶段，灭菌主要在保温阶段实现，但升温和降温阶段也有一定贡献。习惯上，保温阶段的时间为灭菌时间，主要计算灭菌时间和热量。升温是采用夹套、蛇管中通入蒸汽直接加热，或在培养基中直接通入蒸汽加热，或两种方法并用，得以实现。在升温阶段，一般认为100℃以上才能起到灭菌作用，它对灭菌的贡献占20％。保温阶段的贡献占75％，降温阶段的贡献只有5％。总体完成灭菌的周期约3－5小时。
根据微生物浓度和比死亡速率，通常以耐热芽孢杆菌为对象，可以计算灭菌时间。
对于热量计算，涉及所需蒸汽量。可用温度、传热系数、培养基质量、比热、换热面积进行衡算。空罐灭菌的消耗蒸汽体积为罐体积的4－6倍。
c作过程
排放夹套或蛇行管中凉水，开启排气阀。由空气管通入蒸汽，对培养基加热。夹套通入蒸汽进行间接加热。
在70℃左右时，从取样管、放料管通入蒸汽。
在120℃时，罐压1×105Pa，打开接种、补料、消泡、酸碱等管阀，排气，并调节进汽和排气量，进行保温维持。料液下的管道都应通入蒸汽，料液上的管道都应排放汽。
保温结束后，依次关闭排气、进汽阀，罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温，使培养基降到所需温度。

2.5.2.2 连续灭菌c作
培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，即连消。
特点：1）可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；2）发酵罐利用率低；3）热能利用合理，易于自动化控制；4）不适合粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；5）增加了连续灭菌设备及c作环节，增加染菌几率。6）对压力要求高，不小于0.45 MPa，一般为0.45-0.8 MPa。
加热器两种，塔式加热器和喷射式加热器。
塔式加热器：一根多孔蒸汽导管和套管组成。培养基从下端进入，流速0.1m/s，蒸汽从塔顶进入，从小孔中喷出，与培养基激烈混合。塔高2－3m，培养基的停留时间20－30s。
喷射式加热器：培养基从中间管进入，蒸汽从料管周围的环隙进入，在喷嘴处快速混合。国内大多数企业采用。
保温设备包括维持罐和管式维持器两种。用保温材料包裹，不直接通入蒸汽。
料液从维持罐上端连续通入到罐底，维持一定时间后，靠罐压流入冷却器。返混严重。
管式维持器：蛇管状，培养基在管内处于湍流区，活塞流动状态，返混为零。
降温：喷淋式冷却器为主，螺旋板式换热器，板式换热器，真空冷却器等。
c作过程：
配料：配料罐，配制培养基。
预热罐：定容和预加热。70－90℃。
加热器（连消塔）：培养基与蒸汽混合，快速升温达到灭菌温度，126－132℃。
维持罐：维持保温培养基的灭菌时间。5－7分钟。
冷却管：从维持罐出来的料液经过冷却水管冷却。40－50℃。输入灭菌底发酵罐中。

2.5.3 空气过滤除菌
空气的组成：氧气、二氧化碳、氮气的混合物，其中还有水汽及悬浮的尘埃，包括各种微粒、灰尘及微生物。
空气严格除菌，达到无菌状态，才能使用。工业中制备大量空气的方法有加热灭菌、静电除菌。在发酵工业中，大多采用过滤介质（filter medium）除菌方法制备无菌空气。

2.5.3.1 原理
微生物体积很小，空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5μm。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的微生物。其原理在于空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降，同时惯性碰撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒，颗粒接触介质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用，另外静电引力也有一定作用。
膜过滤技术已得到发展，膜过滤器也用来空气除菌，常用的滤膜有硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜等。其原理在于微生物和微粒（约0.5-20μm） 等大于滤膜的网眼直径(0.3μm)，被直接截留于表面。另外沉降作用和静电吸附对除去微粒和尘埃等也有一定贡献。

2.5.3.2 发酵空气的标准
连续一定流量的压缩无菌空气。空气流量：VVM：单位时间（min）单位发酵液体积（m3）内通入的标准状态下的空气体积（m3），一般在0.1-2.0。压强：压力表显示0.2-0.4 MPa，克服下游阻力。空气质量：相对湿度小于70％；温度比培养温度高10－30℃；洁净度100级，或失败率10－3。

2.5.3.3 空气预处理与设备
采风塔：在工厂的上风头，高度一般在10m左右，设计流速8m/s。可建在空压机房的屋顶上。
粗过滤器：安装在空压机吸入口前，前置过滤器。作用是截留空气中较大的灰尘，保护压缩机，减轻总过滤器的负担，也能起到一定除菌作用。介质为泡沫塑料（平板式）或无纺布（折叠式），流速0.1-0.5 m/s。要求是阻力小，容灰量大。
空气压缩机：作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。
空气贮罐：消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。螺杆和涡轮式提供均匀连续空气可省去。设置在空压站附近。
冷却器：空气压缩机出口气温一般在120℃，必需冷却。在潮湿季节，除湿。空气冷却器的传热系数为105W/(m2 ℃)。采用双程或四程结构，两级串联使用。第一级循环水冷却，第二级低温水（9℃）冷却。设置在发酵车间外。压缩空气每经过1m管道，温度下降0.5-1.0℃。

2.5.3.4 油水分离与设备
气液分离设备：除去空气中油和水，保护过滤介质。旋风分离器和丝网除沫器两类。
旋风分离器，利用离心沉降原理。结构简单，阻力小，分离效率高。压缩空气的速度15－25m/s，切线方向进入旋风分离器，在环隙内做圆周运动，水滴或固体颗粒被甩向器壁，而收集。完全除去20μm以上离子，对10μm离子的分离效率为60－70％。
丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对1μm以上的雾滴除去率98％。
空气加热设备：空气相对湿度仍然为100％，需要降到70％以下，才能进入空气过滤器。列管式换热器，空气走管程，蒸汽走壳程。套夹式加热器，空气走管程，蒸汽走夹套。

2.5.3.5 空气过滤介质与设备
要求除菌效率高，耐受高温高压，不易被油水污染，阻力小，成本低，易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、超细比例纤维纸、石棉滤板等。
绝对过滤器：介质孔径小于被截留的微生物体积，如四氟乙烯、纤维素树脂微孔滤膜。
深层过滤器：介质空隙对于被截留的微生物体积，但有一定厚度，靠静电、扩散、惯性、拦截。棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉过滤、金属烧结管等。
实验室采用一级过滤器，生产规模设置二、三级过滤器，第一级为总过滤器，二、三级为分过滤器。
纤维及颗粒介质过滤器：圆筒形，直径2.5－3m。孔径10－15mm。空气从下方进入，上方引出。常用介质棉花、玻璃纤维、活性炭等。空气流速0.2-0.3m/s。可作为总过滤器。
过滤器的灭菌：通入蒸汽，0.2－0.4MPa，45分钟。压缩空气吹干，备用。总过滤器每月灭菌一次。应该有备用过滤器，灭菌时交换使用。
纸过滤器：超细玻璃纤维纸为介质，孔径1－1.5um，厚度0.25-0.4 mm，填充率14.8%。除菌效率很高，0.3μm粒子，99.99%。空气流速0.2-1.5 m/s。阻力很小。可作为终端过滤器。
金属烧结管过滤器：几十至上百根金属微孔过滤管安装在不锈钢壳体内组成。孔径10－30μm，处理能力达100m3/min。特点：寿命长，耐高温，阻力小，安装维修方便。可作为终端过滤器。
微孔膜过滤器：不锈钢中心柱，滤膜做成折叠型的过滤层，绕在中心柱上，外加耐热的聚丙烯套。特点：体积小，处理量大，压降小，除菌效率高，能除去0.01μm以上粒子。流速0.5-0.7m/s，压降小于100Pa。一般前置空气预过滤器、蒸汽过滤器，延长其使用寿命。膜材料有硼硅酸纤维，预过滤器，除去灰、垢；聚偏二氟乙烯，终端过滤器；聚四氟乙烯，终端过滤。
新型子弹状膜过滤器：过滤膜是“皱褶膜”，体积小，阻力小，过滤面积大，膜易更换。棉花和活性炭填充时，体积大，吸油水能力强。超细玻璃纤维纸除菌效率高，但易被水油污染。新型过滤器将取代传统过滤器。

2.5.3.6 空气过滤除菌的工艺流程
为了获得无菌空气，一般采用三个主要工段。
（1）提高空气的洁净度：前过滤器可减少压缩机活塞和气缸的磨损，减少介质负荷。
（2）除去空气中油和水：采用分级冷却，一级冷却采用30度左右的水使空气冷却到40－50℃，二级冷却器采用9℃冷水或15－18℃地下水，使空气冷却到20－25℃。冷却后，空气湿度提高了100％，湿度处于露点以下，油和水凝结成油滴和水滴，在空气贮藏罐内沉降大液滴。旋风分离器分离5μm以上的液滴。丝网除沫器分离5μm以下液滴。
（3）获得无菌空气：分离油水后的空气湿度仍然达100％，温度稍下降，就会产生水滴，使介质吸潮。加热提高空气温度，降低湿度（60％以下）。这样空气温度达30－35℃，经过总过滤器和分过滤器除菌后，得到符合要求的无菌空气。

2.5.4 无菌检查与杂菌控制
杂菌的检测与控制是十分重要的，杂菌的污染将严重影响产量和质量，甚至倒罐。
杂菌检测的主要方法为显微镜检测和平板划线检测两种，显微镜检测方便快速及时，平板检测需要过夜培养，时间较长。检测的原则是每个工序或一定时间进行取样检测，确保下道工序无污染。
发酵污染杂菌的原因复杂，但归结起来主要有种子污染、设备及其附件渗漏、培养基灭菌不彻底、空气带菌、技术管理不善等几方面。

2.5.4.1 无菌试验方法与染菌的判断
肉汤培养法：用装有酚红肉汤的无菌试管取样，放入37℃恒温培养。
斜面培养法：空白无菌试管取样，接种于斜面培养基，37℃培养。
种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次。
以酚红肉汤反应和双碟检查为主，镜检为辅。连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化，或双碟上连续3个时间样品长出杂菌，即判断为染菌。酚红肉汤不明显，要结合镜检。

2.5.4.2 培养基灭菌不彻底及其控制
培养基灭菌不彻底是常见的导致发酵过程被污染杂菌的原因。最主要原因是由于蒸汽压力或用量不足、灭菌时间不够引起的，灭菌时产生大量泡沫、有难溶固体颗粒或罐内污垢堆积也会直接影响了灭菌效果，另外设备制作或安装不当，蒸汽不能到达，造成灭菌死角。
根据造成灭菌不彻底的原因，可采取相应的措施。保证灭菌所需的蒸汽压力、用量和时间。为了防止产生大量泡沫，升温时间不宜太快，要适当；含糖和含氮培养基可分开灭菌，进气和排气阀门开启要缓慢。

2.5.4.3 空气带菌及其控制
空气过滤器效能下降，除菌失败，导致通入污染空气。空气除菌环节较多，每一个环节的失控就会导致灭菌失败。包括管件穿孔与渗漏带入杂菌和过滤介质松动、老化、吸潮等，使过滤除菌性能下降所致。
可通过定期检查管件、更换过滤介质和加强检修来解决。

2.5.4.4 设备及其附件渗漏引起的污染及其控制
发酵设备及其附件的渗漏是化学和电化学腐蚀、机械磨损共同作用引起的，一旦设备及其附件的渗漏，就会引起污染。冷凝蛇管和夹套的穿孔渗漏，会使冷却水污染杂菌。阀门渗漏，外界的空气或水会进入发酵罐，引起污染。
对于设备失修、渗漏引起杂菌污染，要建立并执行完善的管理制度、c作制度与规程，加强技术设备管理，定期检修和维护发酵设备及各个环节，杂菌污染是可以杜绝的。一旦发现污染，要及时处理。

2.6 微生物发酵培养技术

发酵工艺过程包括种子扩大培养和发酵培养。对于发酵过程首先要选择合适的培养基，其次提供适宜的环境条件。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。
2.6.1 种子制备过程
种子的制备包括孢子制备和发酵种子制备，是种子的逐级扩大培养过程。
将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
2.6.1.1 孢子制备
孢子的制备是实验室种子制备阶段，包括琼脂斜面、固体培养基上活化，培养。
菌种的活化是将休眠状态的保藏菌种接到固体培养基上，在适宜条件下培养，使其恢复生长能力的过程。
2.6.1.2 生产种子制备
（1）摇瓶种子制备：孢子发芽和菌丝发芽速度慢的菌种要将孢子经摇瓶培养成菌丝后转入种子罐，一般分为母瓶、子瓶。
（2）种子罐种子制备：一般可分为一级种子、二级种子、三级种子。级数决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理利用，目的是形成一定数量和质量的菌丝。
种子罐的作用在于使孢子瓶中有限数量的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌体，接入发酵罐培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这一般根据菌种生长特性及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量比例少，故种子罐相应也少。
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关，如改变种子罐的培养条体加速菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
2.6.2种子质量控制
2.6.2.1 培养基
培养基的原材料的产地、品种、加工方法和用量对种子质量影响很大。
放线菌孢子采用琼脂斜面培养基。
霉菌孢子以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。
细菌一般采用碳源有限而氮源丰富的配方。
为保证孢子培养基的质量，斜面培养基所要用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵合格后才能使用。
2.6.2.2 培养培养条件
微生物生长温度区间较宽，但获得高质量孢子最适温度区间狭窄，严格控制孢子形成的斜面培养温度。相对湿度影响也较大，真菌对湿度要求偏高，放线菌偏低。
2.6.2.3 种龄与接种量
接种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐和发酵罐时的培养时间，即种子培养时间。工业发酵生产，一般选择生命力旺盛的对数生长期，菌体量未达到最高峰时接种较为合适。
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的生长繁殖速度，应根据不同的菌种选择合适的接种量。接种量一般为5－20％。生产中常用的措施是加大接种量和采用丰富培养基获得高产。
双种法：两只种子罐接种一只发酵罐。
倒种法：从发酵罐中取出一定量发酵液，接种到另一个发酵罐。
2.6.3 培养技术
发酵过程中的主要培养方法包括传统的固体表面培养和液体深层培养及其现代正在发展中的固定化培养和高密度培养等多种方法，针对不同菌株应选择不同的培养方法，以实现最佳生产过程。
2.6.3.1 固体表面培养技术
固体表面培养(solid surface culture)是用接种针或环、涂布器等将菌种点种、划线或涂布在固体培养基的表面，进行培养，常常用于菌种的分离、纯化、筛选和鉴定等。固体表面培养的容器可以是试管或培养皿，用琼脂粉作为支持介质，把培养基制成斜面或平板，用棉塞封闭管口或用Parafilm封口膜封闭培养皿，倒置平板，在适宜温度下生长。
2.6.3.2 液体深层培养技术
液体深层培养(liquid submerged culture )是把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长的一种培养方法。深层液体培养一般需要通入空气并进行搅拌，是传统的微生物发酵培养方法。
2.6.3.3 固定化培养技术
固定化培养(immobilized culture)是把固体培养和液体深层培养特点相结合的一种方法，把菌体活细胞固定在固体支持介质上，进行发酵培养。常用固定化的方法有包埋、吸附、共价键交联等，载体介质有卡拉胶、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、纤维素，葡聚糖等。固定化培养的优点在于：（1）实现高密度培养，不需要多次培养和扩大，缩短发酵周期。（2）细胞可较长期、反复或连续使用，稳定性好。（3）有利于提高产量。（3）发酵液中菌体少，有利于产物的分离纯化。固定化培养是未来最具潜力的制药微生物的培养方法。
2.6.3.4 高密度培养技术
高密度培养（high cell density culture）是指菌体浓度（干重）至少达到50g/L以上的一种理想培养，是发酵工艺的目标和方向。高密度培养没有绝对的界限，根据Riesnberg理论计算，大肠杆菌最大菌体密度可达400g/L，考虑培养基和其他因素，菌体密度实际可达160～200g/L。高密度培养的优点在于缩小发酵培养体积，增加蛋白质表达量，低生产成本，提高生产率。同时，形成的包涵体更加紧密，蛋白质较纯，有利于下游纯化c作。
2.6.4 发酵培养的c作方式
按c作方式和工艺流程可把发酵培养分为分批式c作、流加式c作、半连续式c作和连续式c作等几种。
2.6.4.1 分批式c作
分批式c作（Batch operation）又称间歇式c作(intermittent operation)或不连续c作（discontinuous operation），是指把菌体和培养液一次性装入发酵罐，在最佳条件下进行发酵培养。经过一段时间，完成菌体的生长和产物的合成与积累后，将全部培养物取出，结束发酵培养。然后清洗发酵罐，装料、灭菌后再进行下一轮分批c作。
在分批式c作过程中，无培养基的加入和产物的输出，发酵体系的组成如基质浓度、产物浓度及细胞浓度都随发酵时间而变化，经历不同的生长阶段。物料一次性装入、一次性卸出，发酵过程是一个非衡态过程。分批式c作是分批装料和卸料，其c作时间由两部分组成，一部分是进行发酵所需要的时间，即从接种后开始发酵到发酵结束为止所需时间，另一部分为辅助c作时间，包括装料、灭菌、卸料、清洗等所需时间之总和。分批式c作的缺点是发酵体系中开始时基质浓度很高，到中后期，产物浓度很高，这对很多发酵反应的顺利进行是不利的。基质浓度和代谢产物浓度过高都会对细胞生长和产物生成有抑制作用。
在发酵工业中占有重要地位，主要是用于作业技术和生物上的原因：c作简单，周期短，污染机会少，产品质量容易控制。
过程动力学难以描述，对基质敏感的产物，次级代谢，抗生素，不适用。因为周期较短1－2天，产率较低，养分已耗竭。
封闭式流量等于零。物料平衡得出：
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.1.JPG[/img]
；菌体浓度的变化；X菌体浓度，g/L；t培养时间，h；μ比生长速率，h-1；
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.2.JPG[/img]
；基质浓度的变化；S基质浓度，g/L；qs比基质消耗速率，g/(g h)；
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.3.JPG[/img]
；产物浓度的变化；P产物浓度，g/L；qp比生产速率，g/(g h)。
YP/X:以生长基础的得率（相对应生长的）得率；
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.4.JPG[/img]
2.6.4.2 流加式c作
流加式c作又称补料－分批式c作（Fed-batch operation），是指在分批式c作的基础上，连续不断补充新培养基，但不取出培养液。由于不断补充新培养基，整个发酵体积与分批式c作相比是在不断增加。控制流加c作的形式有二种，即反馈控制和无反馈控制。无反馈控制包括定流量和定时间流加，而反馈控制根据反应系中限制性物质的浓度来调节流加速率。最常见的流加物质是葡萄糖等能源和碳源物质及氨水等控制发酵液的pH值。
只有输入，没有输出，体积增加。
S0为起始时限制性基质的浓度，X0为起始菌体浓度，那么t时的菌体浓度X为
菌体浓度：
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.5.JPG[/img]
；YX/S为基于基质的细胞得率系数；
当St＝0，最终菌体浓度为Xmax，假定（一般情况下）Xo《Xmax，所以，Xmax = YX/SS0（近似）
如果在X＝Xmax时开始补料，稀释速率为D：
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.6.JPG[/img]
；F为补料流速，V发酵液体积
在实际c作中，S0远远大于Ks，残留基质浓度变化非常小，可以看成零。
补加的营养物质与细胞消耗的营养物相等，（dS/dt＝0）；随着时间推移，微生物量增加，但浓度保持不变，（dX/dt＝0）。所以，此时的培养状态为准恒定状态。
优点：随着菌体的生长，营养物质会不断消耗，加入新培养基，满足了菌体适宜生长的营养要求。既避免了高浓度底物的抑制作用，也防止了后期养分不足而限制菌体的生长。解除了底物抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖效应；避免了前期用于微生物大量生长导致的设备供氧不足；可用于理论研究。不产生微生物的老化变异；产物浓度较高，有利于分离；使用范围广。
2.6.4.3 半连续式c作
半连续式c作(Semi-continuous operation)又称反复分批式或换液培养，是指菌体和培养液一起装入发酵罐，在菌体生长过程中，每隔一定时间，取出部分发酵培养物，同时在一定时间内补充同等数量的新培养基；如此反复进行，放料4－5次，直至发酵结束，取出全部发酵液。与流加式c作相比，半连续式c作的发酵罐内的培养液总体积保持不变，同样可起到解除高浓度基质和产物对发酵的抑制作用。延长了药物合成期，最大限度利用了设备。是抗生素生产的主要方式。
带放：间歇取出部分发酵液，与正常放罐的发酵液一起去提炼车间。
缺点：失去了部分生长旺盛的菌体；一些前体丢失；非生产菌突变。
2.6.4.4 连续式c作
连续式c作（continuous operation）是指菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中，不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态的发酵条件，促进了菌体的生长和产物的积累。连续c作的主要特征是，培养基连续稳定地加入到发酵罐内，同时产物也连续稳定地离开发酵罐，并保持反应体积不变。发酵罐内物系的组成将不随时间而变。由于高速的搅拌混合装置，使得物料在空间上达到充分混合，物系组成亦不随空间位置而改变，因此称为衡态c作。
优点：这种方式也适合于菌体代谢生理的研究；所需设备和投资较少，发酵培养的自动化控制；减少了分批式培养的每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等c作时间，提高了产率和效率；产量稳定性优越。连续式c作可以不断收获产物，能提高菌体密度。
缺点：由于连续c作过程时间长，管线、罐级数等设备增加，杂菌污染机会增多，细胞易发生变异和退化，有毒代谢产物积累等，使连续c作受到了限制。在制药生产中还未使用。
连续培养体系为衡化器chemostat：细胞的生长受一种限制性组分的控制。
发酵达到稳态时，放掉的细胞量与生成的细胞量相同。稀释速率D＝F/V；F为进料流速，V发酵液体积。细胞的生长速率dX/dt＝μX－DX。在稳态，dX/dt＝0，所以μ＝D。
通过补料速率控制生长速率，
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.7.JPG[/img]
；
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.8.JPG[/img]
（Monod方程，比生长速率与限制性基质浓度的关系）；Ks为基质利用系数，相当于一半最大比生长速率时的浓度，可以看成是菌体对基质的亲和力。
残留基质浓度变化为;
[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.9.JPG[/img]
；基质输入－基质输出－细胞消耗
稳态时，
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[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.11.JPG[/img]
；所以
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[img]http://202.113.13.67/course/zhiyao/upload/Image/images/image2/2.6.13.JPG[/img]

细胞的生长导致S下降，直至残留浓度维持μmax＝D。如果基质浓度低于，细胞的流失率大于生成率，则趋于S增加，导致生长增加，恢复平衡。

2.7 发酵工艺过程的控制

2.7.1 发酵过程的主要控制参数与检测
2.7.1.1 物理参数
物理测量：温度、压力、体积、流量等；
温度：是指发酵中的所维持温度，是重要的参数，由温度计直接读出。温度的高低直接关系到细胞的酶活性和反应速度、培养基中的溶解氧和传递速度、菌体的生长速度和产物合成速度等。
罐压：罐体内维持正常的压力。罐压的测定是原位传感，压力计上直接读出。发酵罐维持正压防止杂菌侵入，罐压影响CO2和O2的溶解度，压力大小对细胞本身有影响。
搅拌速度（r/min）：每分钟搅拌器的转动次数。影响氧等气体在发酵液中的传递速度和发酵液的均匀程度。搅拌功率（kw）影响液相体积氧传递系数。
空气流量（v/(v•min)）：每分钟单位体积发酵液内通入的空气体积，影响供氧及其他传递。由流量计直接读出。
粘度（Pa•s）：反映细胞生长或形态，用表观黏度表示。黏度高时，对氧传递阻力达。
相对菌丝浓度：浊度（％），反映单细胞生长状况。
料液流量（L/min）：控制流体进料的参数，用每分钟进入的体积表示。
温度计、压力计、通气量、搅拌转速（测速电机）等均是原位传感器，安装在发酵罐内，直接与发酵液接触，给出连续响应信号。
2.7.1.2 化学参数
化学测量：基质、前体、产物等的浓度；pH、溶氧、CO2溶解度、氧化还原电位、气相成分等。
pH：产酸和产碱的生化反应的综合结果，与菌体生长和产物合成有关。
基质浓度：发酵液中糖、氮、磷等营养物质的浓度。它们影响细胞生长和代谢过程，是提高产物产量的重要调控手段。
溶解氧浓度：氧是细胞呼吸的底物，氧浓度的变化对细胞影响很大，也反映了设备的性能。常用绝对含量表示，也可用饱和氧浓度的百分数表示。
氧化还原电位：培养基的氧化还原电位是各种因素的综合影响的表现，它要与细胞本身的电位相一致。是重要的控制参数之一。影响微生物生长及其生化活性。
废气中氧气浓度和二氧化碳浓度：废气中的氧含量和细胞的摄氧率有关，二氧化碳就是细胞呼吸释放出，测定废气中的氧和二氧化碳含量可以计算出细胞的摄氧率、呼吸率和发酵罐的供氧能力。
产物的浓度：在发酵液中的所含目标产物的量，可以用质量表示，也可用标准单位表示。如µg/ml, U/ml等。产物量的高低反映了发酵是否正常，判断发酵周期。
pH计、溶氧电极等是原位传感测定，基质浓度、代谢产物等往往需要人工取样，离线仪器分析。
信息具有不连贯和迟至性。如果连接对流动注射分析（FIA）系统和高效液相层析（HPLC）系统，则可实现发酵液成分的在线测定。FIA可分析葡萄糖、氨离子和硫酸盐浓度；HPLC可分析有机酸、酚类、红霉素、其他副产物。气相色谱可分析乙酸、乙醇、甘油、酮类等、尾气。
2.7.1.3 生物参数
菌丝形态：衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化。菌体的形态需要离线在显微镜下观察。
菌丝浓度（cell concentration）：是指单位体积培养液内菌体细胞的含量，可用质量或细胞数目表示。对于微生物而言，经常简称菌浓。菌体浓度也需要离线测定。
根据发酵液的菌体量、溶解氧浓度、底物浓度、产物浓度等，计算菌体比生长速率、氧比消耗速率、底物比消耗速率和产物比生产速率，这些参数是控制菌体代谢、决定补料和供氧等工艺条件的主要依据。
2.7.2 菌体浓度的影响及其控制
在一定条件下，菌浓的大小不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞的生理特性不完全相同的分化阶段。
1．菌浓大小与生长速率有密切关系
菌体生长速率主要取决于菌种的遗传特性和培养基成分与条件。比生长速率大的菌种，菌体浓度增长迅速，反之就缓慢。细胞体积微小、结构和繁殖方式简单的生物，生长快，反之，体积大、结构复杂的生物，生长缓慢。在一定浓度范围内，比生长速率随着浓度增加而增加，超过上限后，浓度增加会引起比生长速率下降，基质前馈抑制作用。
2．菌浓对发酵得率有重要影响
在适宜的比生长速率下�